Культивирование лактозоусваивающих дрожжей в технологии лактулозы

14-05-2014, 17:21

Использование биотрансформации лактозы в технологии лактулозы давно привлекало внимание исследователей и даже запатентовано. В системном виде способы утилизации лактозы в биотехнологии лактулозы рассмотрены П.Б. Новаковым под руководством проф. И.А. Евдокимова.
Для микробиологической утилизации лактозы в концентрированных растворах авторами было предложено использование дрожжей. Такой выбор обусловлен высокой скоростью утилизации лактозы, метаболической активностью при повышенном содержании сухих веществ в среде в широком диапазоне условий культивирования; способностью полностью окислять углеводы в аэробных условиях, не выделяя больших количеств метаболитов органического происхождения.
Для экспериментальных исследований были выбраны 4 штамма дрожжей: Candida kefyr У-203, Trichosporon pullulans Y-1536, Leucosporidium scotti К-1537, Saccharomyces lactis SK. Объектами исследований, помимо штаммов дрожжей, являлись модельные растворы, состав которых приведен в табл. 13.18.

В соответствии с исследованиями в работе получены следующие результаты.
Влияние способа приготовления посевного материала на интенсивность окисления лактозы. Исследовали два способа приготовления посевного материала. По первому способу посевной материал дрожжей S. lactis SK получали при температуре 30 °С в две стадии: на поверхности агаризованного модельного раствора молочного сахара-сырца и затем глубинным способом в растворе молочного сахара-сырца. На обоих стадиях выращивание проводили в течение (36 ± 4) ч. Второй способ исключал выращивание посевного материала глубинным методом. Культивирование проводили в биореакторе, содержащем 500 ±10) см3 среды при постоянной аэрации с интенсивностью (50 ± 10) л/ч и температуре 30 °С, без коррекции pH.
Графическая интерпретация результатов эксперимента приведена на рис. 13.18 и 13.19.

При первом способе приготовления посевного материала активность последнего значительно ниже. Об этом свидетельствует более продолжительная лаг-фаза (рис. 13.18) и соответственно незначительная метаболическая активность дрожжей в первые 9-11 часов культивирования (рис. 13.19). Применение второго способа приготовления посевного материала способствует более быстрому окислению лактозы. В дальнейших исследованиях использовали второй способ приготовления посевного материала.
Влияние различных видов дрожжевого экстракта на интенсивность окисления лактозы. Для оценки влияния различных видов дрожжевого экстракта на интенсивность окисления лактозы были использованы модельные растворы на основе фармакопейного молочного сахара. В модельный раствор 1 добавляли экстракт хлебопекарных дрожжей, в модельный раствор 2 — экстракт кормовых дрожжей (ЭКД). Условия культивирования были аналогичными в описанным выше.
Анализ экспериментальных данных (рис. 13.20, 13.21) показал, что продолжительность логарифмической фазы роста при культивировании дрожжей в модельном растворе 1 на 3-4 часа больше, что обеспечивает увеличение концентрации жизнеспособных клеток приблизительно на 150-300 млн./см3 по сравнению с модельным раствором 2.
Применение экстракта хлебопекарных дрожжей обеспечивает более эффективное накопление биомассы, окисление и утилизацию лактозы по сравнению с ЭКД.

Изучение окисления лактозы в модельных растворах молочного сахара различного качества. Влияние качества молочного сахара на интенсивность окисления лактозы оценивалось по показателям роста и потребления сухих веществ дрожжами в модельных растворах молочного сахара-сырца и фармакопейного (рис. 13.22, 13.23).
Более высокая метаболическая активность дрожжей наблюдается в модельном растворе молочного сахара-сырца, что, в свою очередь, является причиной более раннего действия лимитирующих рост факторов (истощение субстрата и накопление продуктов метаболизма).
О более интенсивном потреблении субстрата в модельном растворе молочного сахара-сырца свидетельствует кинетика изменения содержания сухих веществ модельных растворов. Повышенная метаболическая активность дрожжей в модельном растворе молочного сахара-сырца обусловлена наличием компонентов (витаминов; минеральных веществ; азотсодержащих соединений), стимулирующих процесс аэробной утилизации лактозы.

Исследование окисления лактозы различными штаммами дрожжей. Авторами были исследованы штаммы S. lactis SK, Т. pullulans Y-1536, L. scottii Y-1537, С. kefyr Y-203. Среди перечисленных штаммов наиболее активный рост и метаболическую активность в условиях глубинного культивирования проявили штаммы S. lactis SK и С. kefyr Y-203. Для сравнения интенсивности утилизации лактозы данными штаммами использовали модельный раствор фармакопейного молочного сахара. Условия культивирования были такими же, как в описанных выше экспериментах. Результаты экспериментов (рис. 13.24, 13.25) свидетельствуют о том, что оба штамма интенсивно накапливают биомассу и утилизируют субстрат. Однако более высокие показатели содержания жизнеспособных клеток и метаболической активности наблюдаются для дрожжей S. lactis.
Скорость окисления лактозы культурой С. kefyr Y-203 снижается по прошествии первых (13 ± 1) ч, что совпадает по времени с началом стационарной фазы роста. Это свидетельствует о более интенсивной утилизации субстрата штаммом С. kefyr Y-203 в период активного накопления биомассы. При культивировании штамма S. lactis SK наблюдается плавное снижение содержания сухих веществ на протяжении всего времени культивирования. Это объясняется стабильным окислением лактозы в экспоненциальной и стационарной фазах роста. Таким образом, несмотря на выявленные различия в кинетике утилизации субстрата, очевидна целесообразность использования обоих штаммов для изучения утилизации углеводов в концентрированных растворах лакто-лактулозы.

Изучение культивирования лактозоусваивающих дрожжей в модельном растворе лакто-лактулозы. Для исследований использовали штаммы S. lactis SK и С. kefyr Y-203. Условия культивирования были такими же, как в исследованиях на модельных растворах молочного сахара. В результате анализа полученных результатов установили (рис. 13.26), что при культивировании дрожжей С. kefyr Y-203 наблюдаются более высокие показатели концентрации жизнеспособных клеток.
При сравнении кривых роста дрожжей отмечено, что в модельном растворе лакто-лактулозы длительность фаз роста приблизительно в два раза больше, вследствие этого время культивирования увеличивается пропорционально по сравнению с модельным раствором фармакопейного молочного сахара. Более продолжительное время культивирования в модельном растворе лакто-лактулозы объясняется меньшей метаболической активностью дрожжей. В свою очередь, пониженная метаболическая активность дрожжей является следствием взаимодействия механизмов индукции и репрессии синтеза ферментов при утилизации нескольких углеводов.
Исследование углеводного состава растворов лакто-лактулозы при культивировании различных штаммов дрожжей. Для изучения углеводного состава растворов лакто-лактулозы в образцах, отобранных через определенные промежутки времени в процессе культивирования, определяли содержание отдельных углеводов методом газо-жидкостной хроматографии. В результате анализа полученных результатов установлено, что штаммы S. lactis SK и С. kefyr Y-203 в процессе метаболизма утилизируют одновременно как лактозу, так и лактулозу (рис. 13.27, 13.28).

Исходя из приведенных зависимостей оптимальное время культивирования, при котором наблюдается максимальная утилизация лактозы и минимальная утилизация лактулозы, определяется характером изменения во времени степени утилизации лактулозы α лактулоза, параметра Δ1 (разность между степенями утилизации лактозы и лактулозы), а также функцией Δ2 = Δ1 - α лактулоза. Используя уравнения α лактулоза = f(т) и α лактоза = f(т), при помощи ЭВМ был определен максимум функции Δ2 = f(т), который соответствует значениям: Δ2 = -9 %, т = 50 ч для штамма S. lactis SK в промежутке времени от 5 до 96 ч и Δ2 = 195%, т = 48 ч в промежутке времени от 0 до 93 ч для С. kefyr Y-203.

Исходя из значений оптимального времени культивирования, установлено содержание углеводов в модельных растворах при культивировании различных штаммов дрожжей (табл. 13.19).

Полученные результаты свидетельствуют о большей эффективности применения дрожжей С. kefyr Y-203 для уменьшения содержания лактозы в сиропах лактулозы. Недостатком микробиологической обработки является достаточно значимые потери лактулозы в процессе микробной утилизации — (22 ± 3)% от начального содержания.
Основные направления практической реализации результатов исследований, представлены в виде схемы на рис. 13.29.

В качестве одного из примеров практической реализации результатов исследований разработана частная технология получения сиропа лактулозы с пониженным содержанием лактозы (ТУ 9229-008-46162908-2004, изменение № 1 от 26,12.06.), в которой использовано культивирование лактозоусваивающих дрожжей для уменьшения содержания лактозы.
В табл. 13.20 приведена сравнительная характеристика сиропа, полученного по разработанной технологии и сиропа «Лактулоза пищевая».